（二）分離的操作方法

　　1、稀釋分離法

　　通過不斷稀釋使被分離的樣品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板與溫度適合溶化了的瓊脂培養(yǎng)基混合，這樣分散的細菌被固定在原處而形成單菌落。

　�。�1）將大腸桿菌或酵母菌用無菌水制作菌懸液。

　�。�2）取若干支無菌試管，每支內(nèi)盛9ml無菌水。

　　（3）吸取1ml制備好的菌懸液，置于第一支含有9ml無菌水的試管內(nèi)，這樣就稀釋了10倍，也就是10-2。

　�。�4）從第一支試管內(nèi)（10-2）吸取1ml注入第二支含有無菌水的試管內(nèi)，這樣就稀釋了100倍，也就是10-2。

　�。�5）用同樣方法操作，直至稀釋至10-5-10-6。

　�。�6）分別精確吸取10-5-10-6各稀釋度菌液0.2ml加入編好號的空無菌平皿中，同一稀釋度重復做三個平皿。

　�。�7）將已溶化并冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基倒入上述各平皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使培養(yǎng)基與菌懸液充分混勻，凝固后倒置于37℃或38℃度恒溫箱中培養(yǎng)24-48小時，觀察平板上菌落生長和分布情況。

　　2、平板劃線分離法

　　平板劃線分離法是接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線而達到分離微生物的一種方法。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的。

　　（1）倒平板 溶化牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平板，水平靜置待凝。

　�。�2）在酒精燈光焰上灼燒接種環(huán)，待冷，取一接種環(huán)金黃葡萄球菌、大腸桿菌混合菌液。

　�。�3）左手握瓊脂平板稍抬起皿蓋，同時靠近火焰周圍，右手持接種環(huán)伸入皿內(nèi)，在平板上一個區(qū)域作之形回劃線，劃線時例接種環(huán)與平板表面成30-40°角度輕輕接觸，以腕力在表面作輕快的滑動，勿使平板表面劃破或嵌進增基內(nèi)。

　�。�4）灼燒接種杯，以殺滅接種環(huán)上尚殘余的菌液，待冷卻后，再將接種環(huán)伸入皿內(nèi)，在第一區(qū)域劃過線的地方稍接觸一下后，轉(zhuǎn)動90°，在第二區(qū)域繼續(xù)劃線。

　　（5）劃畢后再灼燒接種杯，冷卻后用同樣方法在其他區(qū)域劃線。

　�。�6）全部劃線完畢后，在平皿底用特種蠟筆注明菌種、日期、組別、姓名。將整個培養(yǎng)皿倒置放入恒溫箱培養(yǎng)。

　�。�7）37℃經(jīng)過24-48小時培養(yǎng)后取出觀察。注意菌落的開關(guān)、大小、顏色、邊緣、表面結(jié)構(gòu)、透明度等性狀。

　　附一 無菌操作環(huán)節(jié)

　�。�1）接種室應保持清潔，用煤粉酚皂液擦洗臺面及墻壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均應用紫外燈滅菌。定期對接種室作無菌程度的檢查。

　�。�2）進入接種室前，應先做好個人衛(wèi)生工作，在緩沖間內(nèi)要更換工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只準在接種室內(nèi)使用。不準穿到其它地方去，并要定期更換、消毒。

　�。�3）接種的試管、三角并瓶等應做好標記，注明培養(yǎng)基、菌種的名稱、日期。移入接種室內(nèi)的所有物品，均須在緩沖室用70%酒精擦試干凈。

　　（4）接種前，雙手用70%酒精或新潔爾消毒，操作過程不離開酒精燈火焰；棉塞不亂放；接種工具使用前后均需火焰滅菌。

　�。�5）培養(yǎng)箱應經(jīng)常清潔消毒。

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